Anti-Ki-67抗體免疫組化抗體是免疫組織化學（IHC）中用于評估細胞增殖活性的關鍵試劑，其檢測結果的準確性直接影響腫瘤的診斷、分型與預后判斷。為確保染色結果可靠、背景清晰、判讀客觀，必須遵循標準化的操作流程。以下是
Anti-Ki-67抗體免疫組化抗體在免疫組化中的正確使用方法。
一、樣本準備
組織固定：手術或活檢組織應立即放入10%中性緩沖福爾馬林中固定6–24小時，避免過度固定導致抗原封閉。
脫水與包埋：經梯度酒精脫水、二甲苯透明后，用石蠟包埋，制成組織塊。
切片：使用切片機將組織切成4–5μm厚的連續切片，貼附于防脫載玻片上，60–65℃烘烤1–2小時，使組織牢固附著。
二、脫蠟與水化
將切片依次浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ（各10分鐘）脫蠟，再經100%、95%、80%、70%梯度乙醇水化，最后用蒸餾水沖洗，準備抗原修復。
三、抗原修復
Ki-67抗原需通過熱誘導修復（HIER）暴露表位。推薦使用：
修復液：pH9.0EDTA緩沖液或pH6.0檸檬酸緩沖液（根據抗體說明書選擇）。
方法：將切片置于修復盒中，加入修復液，使用高壓鍋、微波爐或水浴鍋加熱至沸騰，維持15–20分鐘，自然冷卻至室溫，再用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。
四、阻斷內源性酶與封閉
過氧化物酶阻斷：滴加3%過氧化氫溶液，室溫孵育10–15分鐘，阻斷內源性過氧化物酶活性，防止假陽性。
血清封閉：滴加正常非免疫動物血清（如山羊血清），37℃孵育15–30分鐘，減少非特異性結合。
五、一抗孵育
抗體稀釋：根據說明書將Anti-Ki-67抗體免疫組化抗體用抗體稀釋液稀釋至合適濃度（濃縮型通常1:50–1:200）。
孵育：滴加一抗于切片上，37℃孵育30–60分鐘，或4℃過夜（可增強信號）。
洗滌：用PBS輕輕沖洗3次，每次5分鐘。
六、二抗與顯色
二抗孵育：滴加酶標二抗（如HRP標記的抗小鼠IgG），37℃孵育30分鐘。
顯色：滴加DAB顯色液，顯微鏡下控制反應時間（通常1–5分鐘），待陽性信號清晰、背景未加深時，立即用蒸餾水終止反應。
七、復染與封片
復染：用蘇木素對細胞核進行輕度復染（30秒–1分鐘），鹽酸酒精分化，氨水返藍。
脫水透明：經梯度酒精脫水、二甲苯透明后，用中性樹膠封片。
八、結果判讀
在顯微鏡下觀察，Ki-67陽性細胞核呈棕褐色。選擇腫瘤細胞密集區，隨機計數至少500–1000個腫瘤細胞，計算陽性細胞百分比（Ki-67指數）。
